Mười hai diễn viên chính của mùa thứ nhất đều quay trở lại trong mùa thứ hai: Matthew Morrison vai huấn luyện viên nhóm hát Will Schuester, Jane Lynch vai huấn luyện viên đội cổ vũ Sue Sylvester, Jayma Mays vai giáo viên cố vấn Emma Pillsbury, Jessalyn Gilsig vai vợ cũ của Will Terri Schuester, cũng như Dianna Agron, Chris Colfer, Kevin McHale, Lea Michele, Cory Monteith, Amber Riley, Mark Salling, Harry Shum Jr. và Jenna Ushkowitz vai các thành viên của nhóm hát, bao gồm Quinn Fabray, Kurt Hummel, Artie Abrams, Rachel Berry, Finn Hudson, Mercedes Jones, Noah "Puck" Puckerman, Mike Chang và Tina Cohen-Chang.[23] Heather Morris và Naya Rivera, trước đây đảm nhận hai vai phụ Brittany Pierce và Santana Lopez, trở thành các diễn viên chính trong phim,[42] cũng như Mike O'Malley vai bố của Kurt Burt Hummel.[43]

Hai diễn viên phụ Harry Shum, Jr. và Ashley Fink cũng đảm nhận các vai Mike Chang và Lauren Zizes, thành viên của New Directions.[44][45] Hai diễn viên phụ khác từ mùa thứ nhất đã không quay trở lại, bao gồm Dijon Talton vai thành viên nhóm hát Matt Rutherford[46] và Patrick Gallagher vai huấn luyện viên đội bóng bầu dục Ken Tanaka (được thay thế bởi Dot-Marie Jones vai Shannon Beiste).[47][48] Các diễn viên phụ tiếp tục tham gia phim bao gồm Iqbal Theba vai hiệu trưởng Figgins, Stephen Tobolowsky vai cựu huấn luyến viên nhóm hát Sandy Ryerson, Romy Rosemont vai mẹ Finn Carole Hudson, Max Adler vai Dave Karofsky, James Earl vai Azimio, Josh Sussman vai phóng viên của tờ báo trường Jacob Ben Israel, Lauren Potter vai thành viên đội cổ vũ Becky Jackson, Jonathan Groff vai bạn trai cũ của Rachel Jesse St. James và Kristin Chenoweth vai April Rhodes.[38][49] Một số nhân vật phụ mới cũng được bổ sung như Chord Overstreet vai Sam Evans,[50][51] Darren Criss vai Blaine Anderson,[52] Cheyenne Jackson vai Dustin Goolsby,[53] Charice vai Sunshine Corazon,[54] John Stamos vai nha sĩ Carl Howell[55] và Gwyneth Paltrow vai Holly Holliday.[56]

Meat Loaf và Barry Bostwick, hai diễn viên chính trong The Rocky Horror Picture Show, xuất hiện trong tập 5[57] với vai quản lý đài truyền hình và đồng nghiệp của Sue.[58] Adam Kolkin đảm nhận vai Kurt lúc 8 tuổi trong tập 3,[59][60] và trong tập 7, một số diễn viên nhí vào vai phiên bản lúc nhỏ của các thành viên trong New Direction.[61] Mẹ của Sue, Doris Sylvester (Carol Burnett), cũng xuất hiện.[62] Nhà báo Katie Couric trở thành khách mời với tư cách là chính mình khi phỏng vấn Sue trong tập 11.[63]

Một chương trình truyền hình thực tế với mục đích tuyển vai công khai cho phim ban đầu được lên kế hoạch phát sóng trên Fox trước khi mùa thứ hai bắt đầu[64][65] nhưng đã bị hủy bỏ do Ryan Murphy muốn tập trung cho phim và lo rằng chương trình này sẽ ảnh hưởng không tốt đến Glee.[66] Ý tưởng này được tiếp tục bởi Oxygen, và The Glee Project bắt đầu lên sóng từ tháng 6 năm 2011 sau khi mùa thứ hai kết thúc. Người chiến thắng nhận được một vai diễn khách mời trong mùa thứ ba của Glee.[67] Cả bốn thí sinh lọt vào vòng chung kết đều đạt giải: hai giải nhất được xuất hiện trong 7 tập và hai giải nhì được xuất hiện trong 2 tập.[68]